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初乳 中文 英文 テンプレート 口腔バイオサイエンス1および口腔リハビリテーション2中国香港特別行政区香港大学歯学部2リゾチームやラクトフェリンなどの唾液中の様々な先天性防御因子は、粘膜保護に寄与し、口腔内のカンジダ集団を調節する. ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染個体では、唾液中のリゾチームおよびラクトフェリン濃度の有意な変化が疾患の進行中に生じることも知られている. したがって、この研究の目的は、12ヶ月間の連続訪問中にHIV感染した中国人6人から得られた遺伝子型に類似した口腔カンジダ・アルビカンス分離株のヒトラクトフェリンおよびニワトリ卵白リゾチームに対するin vitro感受性を決定することであった. ランダムに増幅された多型DNAアッセイを用いて、遺伝子型の類似性(合計50)を評価した. リゾチームおよびラクトフェリンに対する生物の感受性を評価するために胚芽芽細胞生存率アッセイを行った. リゾチーム(30μg/ ml)またはラクトフェリン(20μg/ ml)のいずれかの生理的濃度への暴露は、全ての分離株の生存率の急激な低下を様々な程度まで引き起こした. アルビカンス単離株は、1回の訪問から次の訪問までのいずれかのタンパク質に対する感受性に有意差を示した;同じ個体の異なる遺伝子型を比較した場合に同様の結果が認められた. 単一の患者から逐次単離された2つの遺伝子型のスピアマン相関分析において、リゾチーム(r = 0. HIV疾患の個体において口腔内に存続するアルビカン単離物は、おそらくは適応応答として、リゾチームのような先天性の唾液抗真菌防御に対する進行性の抵抗性を発達させる. しかし、Candidisolatesの大部分は、口腔環境に豊富に存在するこれらの非特異的な宿主免疫メディエーターに苦しむようである. カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染およびAIDS(13,38)を有する患者における口腔カンジダ症の主な原因であり、. エイズ患者の約90%は、病気のある段階で口腔咽頭または食道カンジダ症に苦しんでいる(38). HIV感染が進行するにつれてカンジダによる口腔内コロニー形成も進行し、予防的抗真菌療法にもかかわらず永続的な口腔居住者となる(1,36,45). DNAフィンガープリンティング法の開発により、Cの新規株の株関連性および出現を調べることが可能になった.

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症候性口腔カンジダ症の有無にかかわらず個体集団を順番にサンプリングすることにより、アルビカン. (5,34,47,60)、他の研究者は、同じ酵母株が連続的な感染エピソードで持続する可能性があることを、例えばカンジダ膣炎において見出した(48,49). これらの研究および他の研究は、複数の感染エピソード(29,36,45)にわたる酵母遺伝子型を追跡したが、口腔内に持続するこれらの遺伝的に類似した株の表現型特性を調査した研究者はあまりいない(43). リゾチーム(ムラミダーゼとも呼ばれる)およびラクトフェリンは、唾液中の2つの主要な非免疫学的抗菌タンパク質であり、口腔内のカンジダ集団を調節すると考えられている(39). 我々のグループを含む多くの研究者が、いくつかのカンジダ種に対するリゾチームのin vitro殺菌活性を調べている(14,25,41,42,44,55). これらの研究は、カンジダ種がリゾチームに曝露された場合に、有意な用量、時間、および株依存の死滅効果を示した. 唾液中の鉄結合性急性期タンパク質であるラクトフェリン(11,54)は、インビトロでの実証可能な殺菌または抗菌効果を有する(8,18,59). 最近、一連の研究で、ヒト初乳から得られた無鉄アポラクトフェリンの抗カンジダ効果を実証した(31,44). 現在、HIV感染者は唾液腺分泌を有意に低下させることが知られている(2,3,12,15,30,46,62). (30)は、唾液ラクトフェリンの分泌免疫グロブリンA(IgA)の著しい減少と並行しての耳下腺ラクトフェリンの減少したアウトプットが、HIV陽性陽性患者の群において観察される頻繁な口腔感染に寄与したことを指摘した(30). にもかかわらず、他の研究者は、HIVに感染した被験者および健常対照における刺激された唾液腺唾液中のラクトフェリン濃度の有意な差異を検出することができなかった(3,24).

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唾液リゾチームに関して、臨床的に検出可能な口腔カンジダ症を有するHIV感染個体におけるリゾチーム濃度の上昇が報告されている(2,3,15,23,56,62). HIVに感染した患者におけるこれらの非免疫防御タンパク質の質および量が研究されているが、疾患進行中の口腔の抗真菌防御へのそれらの寄与は事実上不明である. アルビカンおよび/またはHIV感染における口腔カンジダ症の発生は、ラクトフェリンおよびリゾチームのような唾液防御に対する耐性を獲得した疾患進行中の酵母の毒性株の出現によるものであり得る. したがって、本研究の主な目的は、Cの遺伝子型に類似した連続分離株の感受性をin vitroで評価し、比較することであった. アルビカン分離株は、HIV感染者のコホートから得られたもので、外来エイズクリニックに1年間にわたる逐次療法セッション中に出席した. 試料を容器に注ぎ出し、直ちに実験室に移し、口腔洗浄液を1,700gで10分間遠心分離し、2mlの滅菌リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁し、30秒間ボルテックス混合した. 次いで、濃縮された口腔洗浄液を、スパイラル・プラーター(モデルDU; Spiral Systems Inc、Inc。)を用いて、Archimedeanらせん中のSabouraudデキストロース寒天(SDA). プレートを37℃で48時間インキュベートし、試料あたり5つまでの酵母コロニーを、単一の研究者によって無作為に選択した(Y. 次いで、純粋な酵母培養物を採取し、滅菌バイアル中の水に懸濁し、20℃で保存した. これらの生物は、細菌チューブ試験、45℃での増殖、クラミド胞子形成およびAPI 20C AUX(Bio-Merieux、Marcy l'Etoile、France)同化試験によって同定され、表現型は、CHROMagar Candidaプレート(CHROMagar、パリ、フランス)(33). Candida dubliniensisを排除するための新たに改良されたAPILAB Plus(Bio-Merieux)アッセイを用いて、それらのアイデンティティを再確認した. 次いで、酵母を70℃で複数のガラスビーズ(Microbank; Pro-Lab Diagnostics、Ontario、Canada)を含むバイアルに保存し、SDA(Gibco Ltd。. 培養物の純度は、グラム染色された生物の可視化および生殖管試験によって定期的に確認された. 70℃で貯蔵されたストック培養物から得られた酵母を、酵母 - ペプトン - デキストロース培地(1%ペプトン酵母抽出物、2%グルコース、1. 37℃で24時間、単一コロニーを酵母ペプトン - デキストロースブロス(1%ペプトン、1%酵母エキス、2%グルコース)20mlに移し、30℃で好気性条件下、 (600nmでの培養物の光学密度の測定によって評価した). インキュベーション後、4,000gで5分間の遠心分離によって酵母を収穫し、1Mソルビトール(脱イオン水に溶解)中で洗浄し、.

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5mgの酵母溶解酵素(Lyticase; Sigma)、スフェロプラストの形成まで少なくとも1時間37℃でインキュベートし、2,500gで5分間遠心分離して回収する. プロテイナーゼK(最終濃度500g / ml)およびドデシル硫酸ナトリウム(最終濃度1%)を添加して溶解し、次いでRNase(500g / ml)を加えて溶解し、55℃で1時間インキュベートした. 13,000gで遠心分離して得られた得られた上清をフェノールで2回抽出し、フェノール - クロロホルムで1回抽出した後、等容量の2-プロパノールを添加してDNAを沈殿させた. サーモサイクリングは、モデルPTC-150-16および25ミニサイクラー装置(MJ Research、Watertown、Mass. 鋳型として約200ngの酵母DNA、10μlのPCR緩衝液(200mM Tris-HClおよび500mM KCl)、200μMデオキシヌクレオシド三リン酸、25mM MgCl 2、1Mプライマー、および1μMプライマーを含む50μlのPCRマスターミックス。. 5UのTaqポリメラーゼ(Life Technologies、Gaithersburg、MD). 最初の5サイクルは、94℃での変性30秒、52℃での2分間のアニーリング(プライマーRSD12; 5CCGCAGCCA3)(Life Technologies)、および2分間のプライマー伸長、続いて94℃で30秒の変性C、57℃での2分間のアニーリング(プライマーRSD12)、および72℃での2分間のプライマー伸長. 鋳型DNAを含まないコントロールチューブを各実験に含め、各反応について再現性を調べた(19,51). 多くの研究者は、口腔突発症の再発エピソードを有するHIV感染患者からのCandidaspeciesが、健康な個体由来の共生株よりも遺伝的に有意に少ないことを報告している(47,60). これは、同じ親株に由来する株が、これらの免疫無防備状態の患者における再発感染によって持続し得ることを意味する. 他の研究者は、免疫学的に感染した患者(AIDS患者を含む)および健常者との血清型の比較について同様の知見を報告している(7). パルスフィールド・ゲル電気泳動、制限断片長多型およびRAPD分析のような様々な異なるDNAタイピング手順が、以前の作業者による個々のカンジダ分離株の遺伝子プロファイルを解読するために使用されているが(34)、最後の方法はこの目的のために他のものと同等に敏感である(6,19). RAPD法は、微量の酵母DNAを必要とするだけでなく、迅速かつ確実に菌株の描写に役立ちます(17,19).

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したがって、本研究では、RAPD技術を用いて、連続的な経口C間の遺伝子型の関連性. 研究のためにプライマーRSD12を選択する前に、我々はRSD6、RSD8、RSD10、およびRSD12などの他のものを評価し(58)、我々のカンジダ株のコレクションを異なる遺伝子型に差別化する際に最も優れた差別的能力を​​示した. 同様の以前の研究(21)と同様に、我々は単一の来院から最大5つの異なる遺伝子型. さらに、同じ患者由来の連続した酵母単離体は、同様のおよび類似しない遺伝子型をもたらし、アイソタイプ分析に対するこの技術の有用性を確認した. ヒトラクトフェリンおよびニワトリ卵白リゾチームのカンジダに対する抗真菌効果を、Nikawaらによって以前に記載された方法に従って試験した. 我々のグループおよび他の研究者は、以前にこれらの芽胞芽細胞感受性アッセイを使用しており(31,32,44,61)、本研究では、. 本研究のネガティブコホートについては、リゾチームとラクトフェリンのそれぞれについて、. HIV感染患者では、アルビカンからリゾチームへのラクトフェリン(ラクトフェリンではない). しかし、健康なコホートから試験された少数の個体(合計5人)のために、これらの知見を確認または反論するためのさらなる研究が必要である. HIV感染を有する個体から単離されたアルビカンは、同じ親株からおそらく誘導された単離物の感受性の有意な変動性がなく、広く類似している. この酵素は、唾液全体よりもプラーク液中に高濃度で存在し(9)、活性化された多形核白血球もこの酵素を細胞外に放出する(20). リゾチームの抗真菌特性は、微生物細胞壁におけるN-グリコシド結合の酵素加水分解および直接カチオン - タンパク質結合に続く細胞質膜への損傷を介して媒介されると考えられている(25). リゾチームとカンジダ種の間の相互作用の研究は、この酵素に対する感受性の有意な間質および種内変異を示した(41,44,55)。これは、連続分離株の結果を考慮する場合に留意すべきである.

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ラクトフェリンに関しては、逐次株のいずれも、12ヶ月の研究期間中にタンパク質に対する感受性の有意な増加または減少のいずれかを一般に示さなかった. ラクトフェリンは、涙や気管支分泌物などの唾液やその他の外分泌物に認められ(26)、多形核白血球の構成成分でもある(4,27). 刺激されていない唾液腺の唾液中のラクトフェリンの濃度は、約7〜20g / ml(10,37)であるが、刺激. ラクトフェリンの殺真菌性は、(i)第一鉄イオンの隔離、酵母代謝に必要な元素鉄の枯渇(28)、 (ii)酵母細胞壁に誘導される構造的変化(32); (iii)ラクトフェリン吸着に起因する細胞内自己分解酵素系の活性化(16). リゾチームと同様に、ラクトフェリンに対するカンジダル感受性の有意な間質および種内変異が以前に観察されている(32,44,50,61). 大部分の連続分離株のFLZおよびFLF値に有意差はなかったが、我々は、遺伝子型I(6株)およびII株(7株)に属する患者HK5由来の2群の単離株において、ラクトフェリンではなく、リゾチームの標準用量は、12ヶ月の研究期間にわたって有意かつ漸進的に減少した. これについての1つの説明は、抗レトロウイルス剤によって制御されているこの個体のカンジダの連続世代が、非特異的な唾液免疫因子リゾチーム(r = 0. 研究されたアルビカンス単離物は、リゾチームに対するそのような耐性の出現を示し、我々のデータは注意深く解釈されるべきである. アルビカン症候群は、HIV疾患の特徴である経口酵母の定着および感染の再発を永続させることがある. 残念なことに、私たちはコホートでの唾液リゾチームまたはラクトフェリン濃度の時間的変動をモニターすることはできませんでしたが、これは抵抗性の出現をさらに明るくするかもしれません. 例えば、HIVタイプ1感染後の唾液腺機能の変化(唾液腺および顎下腺)の変化を示す報告があり、唾液組成および出血(流速)の両方に影響を及ぼす(12,30). リゾチーム濃度の上昇は、刺激された顎下顎下または舌下唾液(3,62)および刺激された唾液腺唾液(23,30)において、HIV感染個体から観察されている. (15)は、年齢および性別が一致する免疫学的に有能な健常被験者と比較した場合、すべての先天性非免疫唾液防御因子が同等に豊富であり、おそらく高濃度で共通の免疫不全を有する患者群に存在することを報告している(15). 我々は以前、HIV感染した中国人の香港コホート(HIV非含有群より23%高い)における混合唾液中の上昇した唾液リゾチーム濃度を報告した. (46)は、HIV関連唾液腺疾患を有する患者がリゾチームおよび唾液IgAのレベルを増加させ、HIV陰性対照と比較して唾液タンパク質のレベルを低下させたことを示した. したがって、本明細書中に報告された少数のカンジダ(Kandida)単離物におけるリゾチーム耐性の出現は、HIV疾患進行中の唾液リゾチームレベルの本質的な上昇に起因し得ることを推測することが魅力的である.

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(30)は、HIV感染を有する44人の被験者群のラクトフェリン産出量が有意に低下し、唾液分泌IgA産生が著しく減少したと報告した. 疾病管理予防IV期エイズ患者センターの分析では、HIV陰性対照と比較してラクトフェリンが減少していた(22). (57)は、15人のHIV感染被験者の群において、口腔内に存在するカンジダの力価が唾液ラクトフェリン濃度に影響されないことを観察した. HIV疾患の間にリゾチームレベルが増加すると思われるのに対し、逆はラクトフェリンの場合のようであり、試験した逐次型アイソタイプのいずれもラクトフェリンに対する感受性の有意な増加または有意な低下を示していない月の期間. 結論として、本データは、HIV感染におけるリゾチームのような唾液中の本来の抗菌防御に対するカンジダ種の適応反応の魅力的な垣間見を与える. 私たちの知るところでは、本研究はこの現象を初めて報告したものであり、報告された知見を明らかにするとともに、HIV病患者の慢性口腔カンジダ症の定着におけるこれらおよび他の口腔分泌物の真の役割を明らかにするためのさらなる研究が保証される.
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